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傳檢測PCR呈假陰性 免疫檢測急謀補上

位於珠海市金灣區的本港上市的麗珠醫藥開發的,新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法),待取得註冊證後展開量產,並加入臨床一期使用。

新科技速遞

新型冠狀病毒COVID-19可迅速人傳人,控制疫情蔓延的其中一個方法,就是快速檢測和隔離。1月14日,WHO就發佈了疑似病例的實驗室檢測指南,以「逆轉錄聚合酵素鏈式反應」(RT-PCR)測試方式。

醫學上為極之凖確的檢測方法。聚合酶連鎖反應(PCR)幾乎檢測病毒最被普遍使用技術。PCR主要是連續擴增某一基因,包括擴增DNA片段 ,被稱為引子(Primer)。

RT-PCR則為PCR改良版,可以利用RNA檢測(冠狀病毒亦只有RNA),RNA鏈被反轉錄成爲互補DNA,作為模板透過PCR進行DNA擴增複製。以新型冠狀病毒為例,只有RNA鏈,更適合作病毒檢測,RT-PCR亦更靈敏,可檢測很低拷貝數量的RNA。

經過RT-PCR擴增片段,科學家開發以實時螢光RT-PCR再經光學系統監測反應中產物量(螢光物質)變化呈現電腦上,稱為qPCR,靈敏度更高,廣泛檢測愛滋病和流感。RT-PCR一般仍要實驗室內檢測,需時約4小時。

武漢放棄RT-PCR

2月12日,據報武漢放棄了RT-PCR,以新方式確認患者後,當日新症大增15000宗。

英國廣播公司(BBC)指,數個國家都傳出RT-PCR出現「假陰性」(False Negative),患者未能第一次檢測發現出來。湖北省只統計有症狀的人,不再以PCR檢測測試結果,作最後確認依據,結果病例暴增。

上周,廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室宣佈,中國工程院院士鐘南山指導下,聯合多家研究機構了研發新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測試劑盒,並已在實驗室和臨床完成初步評價。

免疫檢測(Immunodiagnostics)通過患者的某些抗體蛋白作測試生物標誌(biological markers),受病毒感染患者的血漿內血清(Serum)會異於不受感染者。本港科學園多家從事免疫檢測,包括從港大醫學院研究團隊成立的ImmunoDiagnostics,甚至可檢測出慢性病。

中國工程院院士鐘南山指導下,聯合多家研究機構了研發新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測試劑盒。圖片來源:中國工程院中國院士館網頁

結合抗體作標記

免疫檢測的原理可檢測中和抗體和結合抗體,中和抗體能夠中和抗原的生化作用,結合抗體則與之結合變成一種有待處理的標誌。免疫檢測以中和抗體試驗專一性頗高,但需以活病毒進行檢測,複製病毒蛋白結構;需在P3級別實驗室進行(香港只有港大才具備P3),危險性也較高。

IgM是一旦受冠狀病毒感染後,最先出現蛋白抗體之一,IgM測試可用來顯示近期感染和發病狀況,數量也較多。隨著患者康復,IgM抗體會消失。

上述免疫檢測以一滴血,以IgM蛋白抗體作標誌, 15分鐘內憑肉眼觀察獲得檢測結果,患者血漿稀釋500至1000倍後,仍能檢測出陽性條帶。劑盒在湖北醫院進行了應用試驗。通過對部分臨床已確診為新型冠狀病毒感染陽性(PCR核酸檢測陰性)患者血樣復檢,檢出相當部分(IgM)陽性,可與核酸的PCR檢測互補。

除了廣州醫科大學,本港上市的麗珠醫藥(上市編號:1513)亦與中國科學院武漢病毒研究所,研製了IgM抗體檢測試劑(膠體金法),已通過體外診斷試劑應急審批答辯,上周進入了快速審批通道,估計日內臨床。

上述生物標誌可用於檢測SARS病毒。麗珠試劑亦利用另一種免疫球蛋白G(IgG)作測試,不過發病較晚期後的患者體內,IgG後才易被偵測,鍾南山只採用了IgM。

但即使完全康復,IgG仍可長期存於血清內。2009年,港大就以IgG檢測與SARS病人有緊密接觸的市民,以SARS的較低傳染性(R0=2.7)發現只有極少病者(0.19%)曾受傳染,卻不出現病癥。

新型冠狀病毒COVID-19的R0遠高於SARS,加上癥狀輕微,未來有關IgG血清測試,為本港帶來更多傳染啟示。

廣州醫科大學報導,可能間接證明了PCR檢測,出現假陰性檢測傳言。也就是說,已受感染患者無法完全以PCR檢測出來。

PCR備受質疑

BBC指有國內記者揭露的狀況;患者六次測試呈陰性後,第七次測試時終於確診。

據本港生物科技初創Biomed首席科技總監周軍衛博士解釋,鐘南山通過檢測受試者血液內,是否出現抗新型冠狀病毒抗體IgM,判斷受試者是否已感染新型冠狀病毒。上述方法不需複製病毒蛋白結構;比較一般免疫檢測開發試劑簡單,不過必須驗血(PCR可只從喉嚨取樣本)。

IgM可達至快速檢測和陽性檢出率。周軍衛表示:「靈敏度是否比RT-PCR為高,則不敢下結論(因沒有數據)。有一點可肯定:IgM檢測更加簡單高效,能有效突破現有檢測技術對人員、場所限制,縮短檢測用時,實現疑似患者的快速診斷和密切接觸人群的現場篩查,推動了診斷篩查的前移。」

BioMed亦以RT-PCR和NGS等方法檢測腸道細菌,RT-PCR被公認為業內最標凖檢測方法。

何以一向穩定的PCR檢測出現假陰性?BBC報導指各國醫生有不同推測;包括取樣時測試操作,亦可能存在問題,集採步驟也有影響。新冠病毒可能深入肺部,從喉部蘸到的樣本,根本找不到病毒;除了病人已經有咳嗽徵狀,病毒才從喉嚨後部採集的樣本偵察出來。

另外,檢測時必須採集一段基因的引子,也就是一小段單鏈病毒RNA,作爲反轉錄後擴增起始點,上述引子以病毒基因一個公認不經常變異區段。如果引子發生變異快速,RT-PCR放大片段對比不一致,也被錯判為陰性。

目前,中國開發的多種試劑,包括華大基因、碩世生物、德國QIAGEN、上海輝睿、上海捷諾、上海泊傑等醫療科技,香港科技大學和澳門大學開發測試,均以RT-PCR為基礎。較早前,新羿生物則與清華大學開發定量檢測試劑盒(數字PCR法),基礎也是RT-PCR。

核酸PCR測試方法受質疑,假陰性原因莫衷一是,已意味須開發其他檢測方法互補,否則無法控制疫情。鍾南山開發護理點檢測,有效補充RT-PCR的不足,免疫檢測。

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